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1.胶体金标记免疫测定技术--免疫胶体金技术的制备方法

时间:2021-12-08 08:23:47|浏览:

继荧光素、放射性同位素和酶等三大标记技术之后,一种固相标记免疫分析技术——免疫胶体金技术(ICG)逐渐发展起来。是一种以胶体金为标记物,利用抗原与抗体的特异性反应,对抗原或抗体物质进行定性甚至定量研究的标记技术。近年来,该技术以其操作简便、观察直观、灵敏度高、价格低廉等优点,在医药、动植物检疫、食品安全监管等各个领域得到广泛应用。

1.胶体金的制备

胶体金是金的水溶液,是指分散相粒径为1-100纳米的金溶胶。在还原剂的作用下,金离子被氯化金溶液还原成金原子,从而凝聚形成特定大小的金颗粒。由于正负离子形成胶体粒子的双电子层结构,溶胶处于稳定状态,故称为胶体。金子。

1.1 制备方法

胶体金的制备大致可分为分散法和还原法。目前采用还原法制备胶体金,主要有:白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、乙醇-超声波还原法、硼氢化钠还原法和鞣酸-钠还原法等。柠檬酸还原法。白磷还原法制备的胶体金颗粒粒径在3nm左右,粒径均匀性好,但白磷易燃易爆,配置时必须注意。柠檬酸三钠还原法是实践中最常用的方法。该过程简单且可重复,胶体金颗粒的大小可以通过调节溶液中柠檬酸三钠的浓度来控制。乙醇-超声还原法在实践中很少使用。一方面是因为工艺控制不好,重现性差。另一方面,产生的金颗粒很小。除了免疫组化电镜技术中使用的胶体金小颗粒外,免疫分析技术中使用的胶体金颗粒一般在50nm左右。硼氢化钠还原法在实践中很少使用。一方面,工艺控制不好,重复性差。另一方面,产生的金颗粒很小。除了使用免疫组织化学电子显微镜技术,金标准的免疫分析技术很少使用。单宁酸-柠檬酸钠还原法是常用的方法之一,胶体金粒径可以通过单宁酸的浓度来控制。但注意:鞣酸溶液必须避光保存,温度必须控制在60°C,否则会影响胶体金的均匀性。

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1.2 影响胶体金制备的因素

除了制备工艺严格外,玻璃器皿和水的清洁度会直接影响胶体金的制备,杂质污染会影响胶体金的均匀性。玻璃容器需要用双蒸水清洗后进行硅化处理。所有溶液必须配置用0.45μm微孔膜处理过的双蒸水。

2 胶体金标记蛋白

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2.1 胶体金打标技术原理

胶体金颗粒表面带有较多的负电荷,可以快速稳定地吸附带正电荷的高分子物质(如抗体分子、植物凝集素和蛋白A),而不会破坏其生物活性。因此,利用胶体金的物理特性标记一些生物活性物质,作为免疫组化抗原定位和抗原抗体检测的免疫探针。

2.2 胶体金标记蛋白的影响因素

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胶体金与蛋白质通过正负电荷之间的范德华引力结合,胶体金颗粒与蛋白质分子之间不存在共价键。用胶体金标记蛋白质的过程是一个物理过程。标记系统的pH值、离子浓度和比例会影响标记效果。一般当胶体金的pH值接近或大于蛋白质的等电点时,胶体金对蛋白质的吸附力最强。反之,当胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,就会结块而失去结合能力。例如标记葡萄球菌蛋白A(SPA)时,SPA的等电点为pI5.1,胶体金的pH值可选择pH< @5.9-6.2。标记单克隆抗体时,胶体金的pH值应在pH8.2。对于含有多种大分子蛋白质的样品食品胶体金,如多价抗体标记,实际上很难满足系统中各种蛋白质分子的等电点要求。为了获得更好的标记条件,可以用低于pH9.0的缓冲液对标记的蛋白质进行透析,将胶体金的pH值调至pH9.0进行标记。实际上很难满足系统中各种蛋白质分子的等电点要求。为了获得更好的标记条件,可以用低于pH9.0的缓冲液对标记的蛋白质进行透析,将胶体金的pH值调至pH9.0进行标记。实际上很难满足系统中各种蛋白质分子的等电点要求。为了获得更好的标记条件,可以用低于pH9.0的缓冲液对标记的蛋白质进行透析,将胶体金的pH值调至pH9.0进行标记。

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